Colture cellulari 3D, il meglio deve ancora venire

Qual è una delle prime cose di cui parlano i professori dinanzi a un gruppo di studenti desiderosi di studiare la biologia? No, la risposta non è la classica domanda ironica sul perché della loro iscrizione. Pensateci meglio…Esatto! La cellula. Le cellule sono l’unità di base strutturale e funzionale di ogni essere vivente, dal più piccolo dei batteri al più imponente dei mammiferi. La cellula è vita, è l’espressione microscopica del nostro essere. Oltre a essere l’argomento centrale della biologia, le cellule sono anche uno strumento di studio essenziale. Certo, studiare elementi così piccoli ha richiesto tanti anni e sforzi da parte della comunità scientifica. Ne abbiamo fatta di strada da quando il termine fu coniato per la prima volta nel 1665 da Robert Hooke. Molte delle informazioni attualmente a disposizione sui processi cellulari sono riconducibili a esperimenti condotti su cellule (appunto!) fatte crescere in condizioni bidimensionali: queste vengono fatte aderire in monostrato su materiale rigido fatto di polistirene o di vetro per poi essere sottosposte a diversi test. In genere, la fase successiva è quella di confermare il fenomeno osservato in vitro attraverso studi in vivo, ovvero attraverso esperimenti che implicano l’utilizzo di animali.

Premetto che il mio intento non è quello di dare un parere su un argomento bioetico così delicato come la sperimentazione animale. L’obbiettivo di questo articolo è quello di parlare di una via di mezzo tra quest’ultima e le tecniche di colture cellulari più tradizionali: le colture 3D. Se da una parte la sperimentazione animale è problematica per ovvie ragioni, è altretanto evidente che le colture 2D abbiano limiti non trascurabili: la crescita in monostrato causa un’adesione polarizzata. Tali caratteristiche fisiche causano una ricezione omogenea di nutrienti e di fattori di crescita dal medium. Di conseguenza, le cellule si propagano in modo anomalo, i ricettori cellulari di superficie si distribuiscono in maniera non realistica e delle sottopopolazioni di cellule capaci di crescere meglio in quelle condizioni vengono selezionate. Appare quindi chiaro che i risultati ottenuti con queste tecniche non rappresentano la realtà. Queste limitazioni hanno favorito l’avvento di numerosi metodi tridimensionali capaci di creare ambienti più fedeli alla realtà. I modelli 3D diventano fondamentali ad esempio per studiare meglio i tumori, il cui sviluppo non dipende solamente dalle cellule tumorali stesse, ma anche dalle complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente. Nel corso degli ultimi anni, l'avvento di nuove tecniche con grande potenziale nello studio di tumori ha consentito una crescita esponenziale dell’interesse intorno ad essi.

Esistono numerose tecniche di coltura 3D: dai metodi Hanging Drop alla stampa 3D, passando per l’utilizzo degli idrogel come strutture di supporto. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e suoi svantaggi e la scelta dipende dal tipo di esperimento, dagli obiettivi perseguiti e dai mezzi economici e tecnici a disposizione, come molte tecniche usate in biologia d'altronde. Tutte hanno come filo conduttore la necessità di formare strutture relativamente regolari chiamate sferoidi. Gli sferoidi cellulari sono aggregati che possono essere fatti crescere in capsule, in sospensione o all’apice di matrici a seconda del metodo di coltura utilizzato. Per la loro architettura tridimensionale, gli sferoidi acquisiscono proprieta' biologiche interessanti che non sono osservabili nelle tradizionali colture in monostrato. Inoltre, rappresentano uno strumento che mima efficacemente le micro-masse tumorali che si formano in alcuni tipi di tumori, micro-masse di dimensioni spaziali al di sotto dei limiti della diagnostica per immagini. Facciamo insieme una rassegna di alcuni di questi metodi.

I metodi Hanging Drop sono sicuramente quelli più semplici, non necessitano nessun supporto e rappresentano un buon compromesso qualità/prezzo. Questi metodi si basano sulla deposizione di una picolissima goccia contenente una sospensione cellulare nel lato interno di un coperchio di una classica piastra Petri. Dopo capovolgimento e chiusura della piastra con il coperchio, la tensione superficiale e la gravità generano una goccia di sospensione pendente che non cade all’interno del recipiente. All’interfaccia tra aria e liquido, le cellule tendono ad aggregarsi e formare i famosi sferoidi. Pur avendo diverse qualità, i metodi Hanging Drop presentano difetti non trascurabili come l’obbligo di utilizzare volumi molto piccoli (circa 50 microlitri) e le tecniche più rudimentali e meno costose non permettono di generare numerosi sferoidi per piastra.

Un’alternativa interessante è rappresentata dalla levitazione magnetica, un metodo che si basa sull’utilizzo di idrogel contenenti nanoparticelle d’oro e di ossido di ferro. Le cellule vengono fatte crescere in monostrato per poi essere trattate con questi idrogel. Dopo l'incubazione, le cellule vengono depositate in piastre a bassissima aderenza che vengono chiuse con coperchi dotati di magneti. Il campo magnetico generato da questi ultimi permette alla cellule di levitare (grazie alle nanoparticelle metalliche) e di formare sferoidi. Durante la formazione degli aggregati, le cellule producono autonomamente elementi tipici della matrice extracellulare come la fibronectina, la laminina e il collagene. Oltre a permettere la formazione di una matrice extracellulare intrinseca (nessun bisogno di supporti artificiali), la levitazione magnetica implica dei tempi di formazione degli aggregati rapidi e compatibili con la maggior parte di quelli richiesti dagli altri metodi. Il difetto più grande è il costo alto delle nanoparticelle e la loro pericolosità per le cellule.

Negli ultimi 15 anni, La stampa 3D sta trovando moltissime applicazioni in vari ambiti della vita umana. Questa tecnologia versatile viene sfruttata in diverse aree biomediche come nella ricerca di base e nel saggio di farmaci. Se le altre tecniche danno ottimi risultati in termini di ottenimento di sferoidi, la stampa 3D offre possibilità esclusive come quella di vascolarizzare gli aggregate. Questa possibilità diventa fondamentale quando si vuole studiare ad esempio le fasi tardive di sviluppo di un tumore. Il metodo della stampa 3D permette di riprodurre complesse strutture in vivo attraverso il posizionamento di materiali biochimici e biologici (tra cui cellule vive) strato per strato. Esistono diverse tecniche di biostampa 3D ma queste ultime presentano importanti svantaggi in termini di costi, di risoluzione e di viabilità cellulare. Lo sviluppo di nuovi « bioinchiostri » bio- e immunocompatibili potrebbe essere una chiave di svolta per il miglioramento di questi metodi.

Tra tutte le tecniche di colture celulari 3D, le piattaforme microfluidiche rappresentano quelle più promettenti, sorpassando i modelli 3D standard in termini di fedeltà di riproduzione delle interazioni tessuto-tessuto. La microfluidica è una disciplina scientifica che si basa sull’utilizzo di volumi molto piccoli di fluidi (10-9-10-8 litri) e di sistemi di camere chiamati microcanali di dimensioni comprese tra 10 e 100 micrometri. Le cellule vengono coltivate nei microcanali e continuamente esposte ad un flusso controllato di fattori di crescita. Nei sistemi più semplici, una camera microfluidica contiene un tipo cellulare tessutale unico con caratteristiche specifiche. Le piattaforme offrono inoltre la posibilità di ricreare vere e proprie interfaccie tra tessuti diversi attraverso l’uso di una membrana porosa posta tra due microcanali contenenti tipi cellulari diversi. Questo metodo, chiamato Organ-on-chip (o Tumor-on-chip se si riproduce un microambiente neoplastico) ha permesso di ottenere risultati formidabili come la ricostruzione di complesse strutture e ambienti come quelli della pelle, del polmone, del fegato e dello stomaco.

Le colture cellulari costituiscono uno strumento indispensabile per lo studio di malattie e per l’elaborazione di terapie specifiche. Nel corso dell’ultimo decennio, la ricerca di alternative valide alla sperimentazione animale e i limiti delle colture tradizionali hanno dato grande impulso alla creazione di metodi sempre più innovativi di colture 3D. Le colture bidimensionali non sono obsolete, le tecniche tradizionali rimarranno sempre strumenti fondamentali e dovranno continuamente essere aggiornate. Alla luce delle possibilità offerte dalle nuove tecnologie, è chiaro che i modelli tridimensionali danno risultati più probanti nelle fasi di studio più avanzate e il loro contributo sarà sempre più importante nel mondo della ricerca biomedica. Penso che sia altamente improbabile che facciano la stessa fine del Cinema 3D.

Attualmente, la sperimentazione animale rimane purtroppo un metodo imprescindibile per lo studio delle malattie e per l’elaborazione di cure efficienti contro di esse. «In vivo veritas!» ripeteva spesso una delle mie professoresse. Riusciremo un giorno a sostituire completamente il modello animale? Ma la domanda fondamentale è: lo sviluppo di un modello «sintetico» capace di riprodurre fedelmente quello umano sul quale studiare le patologie non implicherà la creazione di altri problemi etici? In ogni caso, dinanzi a tali problematiche, mi piace citare una frase famosa di Victor Hugo, « l’avvenire è la porta, il passato ne è la chiave».

di Franscesco Kayath

BIBLIOGRAFIA

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